Корабль был построен в 1763 году на верфи Главного адмиралтейства в Санкт-Петербурге под руководством корабельного мастера Д. Ульфова. Назван в честь небесного покровителя 10-летнего сына императрицы Екатерины 2 наследника цесаревича Павла Первого, родившегося 20 сентября 1754 года, в день св. Евстафия. До 1768 года находился в составе Балтийского флота, участвовал в практических плаваньях. В июле 1764 года принял участие в показательном сражении в заливе Рогервик, за ходом которого наблюдала с берега Екатерина 2. участвовал в Русско-турецкой войне (1768 – 1774 г.). в конце 1769 года вышел из Кронштадта под флагом адмирала Г. А. Спиридова во главе первого отряда кораблей первой Архипелагской экспедиции. В феврале 1770 года прибыл к побережью Греции.
24 июня (5 июля) 1770 года эскадра обнаружила в Хиосском проливе (в Эгейском море) главные силы турецкого флота и с ходу в кильватерной колонне с короткой дистанции (50—70 м) атаковала его авангард и часть центра. В самом жарком огне оказался «Евстафий»: во время отчаянного абордажного боя начался пожар на флагманском турецком корабле «Реал-Мустафа», и его горящая грот-мачта упала на русский флагман. Когда Г. А. Спиридов убедился, что спасти «Евстафий» невозможно, он перенес свой флаг на линейный корабль «Три Святителя» . Вскоре «Евстафий» взорвался, а вслед за ним взлетел на воздух и «Реал-Мустафа». Взрыв обоих кораблей и ураганный огонь русской корабельной артиллерии вызвали панику на судах противника. Они спешно и в беспорядке отступили в Чесменскую бухту, где были заблокированы русской эскадрой.